Болеют ли растения раком?
Рост каллуса внешне напоминает рост опухолей у животных. Но к счастью для растений, деление клеток у них всегда зависит от двух гормонов: ауксинов и цитокининов. Чтобы рост каллуса прекратился, достаточно сократить поступление хотя бы одного из них (клетки каллуса сами, как правило, не способны образовывать эти вещества). Однако, как вы помните, многие вредители и возбудители болезней растений синтезируют или ауксины, или цитокинины (в редких случаях — и те, и другие) для того, чтобы контролировать рост растительных клеток. Тогда образуются «ведьмины мётлы», галлы и прочие болезненные разрастания на теле растения. Но стоит только тем или иным способом уничтожить возбудителя, болезненный рост сразу же остановится. Таким образом, ни каллус, ни галлы не являются злокачественными раковыми образованиями.
Рис. 1. Корончатый галл на ветке сирени— злокачественная опухоль, вызванная агробактериями (Agrobacterium tumefaciens)
Тем не менее, растения болеют раком. Его вызывают бактерии из семейства Ризобиевые (Rhizobiacae), которые относятся к роду агробактерии (Agrobacterium). На месте инфекции образуется неорганизованно делящаяся масса клеток, похожая на каллус (рис. 1). Если агробактерии убить при помощи антибиотиков, то рост опухоли по-прежнему продолжится. Возникает злокачественная опухоль, рост которой растение не может контролировать.
При анализе содержания гормонов в опухоли оказывается, что уровень и ауксинов, и цитокининов повышен. Каждая клетка опухоли способна самостоятельно производить эти гормоны и больше не зависит от остальных частей растительного организма.
Агробактерии — природные «генные инженеры»
Агробактерии поражают преимущественно двудольные растения, среди которых наиболее заметны опухоли на деревьях и кустарниках. Агробактерии вызывают рак корней винограда (возбудитель — A. vitis, агробактерия «виноградная»), корней малины (A. rubi, агробактерия «малинная»), болезнь корончатого галла у широкого круга хозяев (A. tumefaciens, агробактерия «опухолеобразующая»). Необычное заболевание, проявляющееся как образование из массы корней, густо покрытых корневыми волосками — болезнь «косматого» или «бородато-го» корня — также вызывается агробактериями (A. rhizogenes, агробактерия «корнеродная»). Есть среди агробактерий и сравнительно «мирный» (непатогенный) вид — A. radiobacter (агробактерия «корневая»), который обитает в тонком слое почвы, окружающем корни растений. A. radiobacter питается корневыми выделениями, но не наносит ущерба самим растениям.
Бактериальный рак корней рододендронов. Возбудитель — бактерия Agrobacterium tumefaciens
Бактериальный рак на корнях и нижней части стебля розы вызывает бактерия Agrobacterium tumefaciens (агробактериум)
Чем же вызваны инфекционные свойства большинства видов агробактерий?
Генетический материал бактерий состоит из нуклеоида (крупная кольцевая молекула ДНК, в которой хранится «основная» генетическая информация), и плазмид (более мелких кольцевых молекул ДНК с меньшей информационной ёмкостью). Свойство агробактерий поражать те или иные виды растений «запрограммировано» именно в плазмидах. В зависимости от типа заболевания эти плазмиды обозначают как Ti-плазмиды (от англ. tu-morinducing — вызывающие опухоли) и Ri-плазмиды (от англ. rootinducing — вызывающие [косматые] корни). При потере плазмид агробактерии теряют свойство вызывать соответствующие заболевания.
Плазмиды обладают целым рядом интересных и практически важных свойств. Во-первых, в одной клетке агробактерии не могут встретиться не только Ti- и Ri-плазмиды, но даже две разных Ti-плазмиды! Каким-то образом первая «поселившаяся» в бактерии плазмида не допускает проникновения и размножения других плазмид, похожих на неё.
Во-вторых, плазмиды способны передаваться от одной бактериальной клетки к другой. Как это ни парадоксально, в почве только 1 — 5% клеток свободно живущих агробактерий «вооружены» Ti- или Ri-плазмидами. Но как только начинается процесс инфекции, плазмиды активно размножаются и передаются от бактерии к бактерии.
В третьих, Ti- и Ri-плазмиды (по сравнению с другими плазмидами бактерий) имеют большие размеры: около 200 — 300 тыс. пар оснований. Это не позволяет при помощи стандартных методик отделить ДНК этих плазмид от ДНК нуклеоида, что создаёт определённые трудности в работе молекулярных биологов с плазмидами.
Какие же гены несут в себе Ti-плазмиды? Для заражения растений наиболее важным оказывается Vir-район (от англ.virulence — способность поражать [растения], патогенность), в котором закодировано довольно много генов. Постоянно работают только два гена: VirA и VirG. Белок VirA — это рецептор на особое вещество фенольной природы —ацетосирингон. Ацетосирингон выделяется при повреждении клеток растений. Белок VirA реагирует на ацетосирингон и передаёт сигнал на белок VirG, который активирует все остальные гены Vir-района. В результате: 1) клетки агробактерий плывут к месту поражения (ориентируясь по увеличению концентрации ацетосирингона); 2) Ti-плазмида начинает размножаться и передаваться другим бактериям того же вида; 3) появляются другие белки-продукты генов Vir-области (рис. 2).
Рис. 2. Функции некоторых белков из Vir-района
Белок VirD1 совместно с белком VirD2 находят в Ti-плазмиде определённые участки, состоящие из 25 пар нуклеотидов, и разрезают их, перебрасывая ковалентную связь с 5?-конца ДНК на белок VirD2. У Agrobacteriumtumefaciens таких участков два: они ограничивают так называемый Т-район (от англ. transferred — переносящийся). Одна из цепей ДНК отделяется и уходит; таким образом, в Ti-плазмиде возникает брешь. Специальная система репарации ДНК застраивает брешь новой цепью ДНК, и из той же Ti-плазмиды можно ещё раз вырезать Т-район, Ti-плазмида в целом сохраняется. Одноцепочечная Т-ДНК, связанная с белком VirD2, в дальнейшем «одевается» при помощи белка VirE2, который не даёт ферментным системам бактериальной клетки разрушить одноцепочечную Т-ДНК. На поверхности клетки агробактерии при помощи разнообразных белков VirB образуется аппарат для переноса ДНК из одной клетки в другую. Именно белки VirB отвечают за перемещение комплекса VirD2 с одноцепочечной ДНК из клетки агробактерии в клетку растения. Белки VirE2 также перемещаются в клетку хозяина. Далее комплекс одноцепочечной Т-ДНК с белками VirD2 и VirE2 проникает в ядро растительной клетки. Белок VirD2 «надрезает» ДНК клетки-хозяина и встраивает Т-ДНК из Ti-плазмиды. Таким образом, происходит процесс встраивания чужеродной ДНК в ДНК клетки растения. После этого клетку растения можно считать генетически модифицированной. В процессе эволюции агробактерии «разработали» механизм получения генетически модифицированных клеток растения, т.е. стали природными «генными инженерами».
Что содержится в Т-районе
Гены, которые содержатся в Т-районе, в самой клетке агробактерии не работают, поскольку у них есть только эукариотические про-моторы. Два из этих генов отвечают за биосинтез ауксинов: iaaH и iaaM. Ещё один ген — iptZ — кодирует ключевой фермент синтеза изопентениладенина (одна из форм цитокининов). Таким образом, попав в геном растения, Т-ДНК вызывает синтез как ауксинов, так и цитокининов (рис. 3). При этом клетки растения-хозяина начинают неорганизованно делиться, образуя опухоль. Однако для того, чтобы деление клеток растения приносило агробактериям пользу, необходимо, чтобы они синтезировали что-либо полезное для агробактерий. Действительно, в состав Т-района входят гены биосинтеза веществ, которые образуются из аминокислот и кетосоединений. Эти вещества получили название опинов. Ни сами растения, ни другие организмы, обитающие на растениях, не могут расщепить опин. И только агробактерии способны «переваривать» тот опин, синтез которого они вызвали.Опинов достаточно много, и каждая Ti-плазмида обеспечивает синтез своего опина (нопалина, агроцинопина, витопина, куркумопина и др.). В самой Ti-плазмиде (но не в Т-районе!) есть гены, отвечающие за «переваривание» соответствующего опина. Это объясняет, почему одна Ti-плазмида, захватив клетку агробактерии, не пускает в неё другую Ti-плазмиду, отвечающую за синтез и метаболизм другого опина. После внедрения ДНК из Т-района клетки опухоли интенсивно делятся и продуцируют именно тот опин, который способна «переварить» агробактерия, вызвавшая данную инфекцию. Если в почве обитают два разных вида агробактерий, то при инфекции первая бактерия каким-то образом не пускает другую, которая питается иным опином.
Рис. 3. После вставки Т-района в клетке растения-хозяина начинается неконтролируемый синтез ауксинов, цитокининов и опинов
На этом основан биологический метод борьбы с агробактериальным раком. Как вы знаете, есть непатогенные агробактерии. Они также «не пускают» другие виды агробактерий к корневой системе растения, через которую и происходит поражение. Если заранее обработать растение определёнными штаммами A. radiobacter, то растение не заболеет ни корончатым галлом, ни корневым раком, ни болезнью бородатого корня. Удивительно, но у некоторых агробактерий в составе плазмид есть не один, а два или даже три Т-района, каждый из которых «обрамлён» последовательностями из 25 нуклеотидов. В случае A. rhizogenesэти участки называют ТL- и TR-районами, а у A. rubi есть TA, TB и TC соответственно. Наиболее удивительно заболевание бородатого (косматого) корня. В TR-районе содержатся те же гены, что и у остальных агробактерий. Они отвечают за синтез ауксинов, цитокининов и опинов. В TL-районе содержатся гены, отвечающие за то, чтобы неактивные формы ауксинов переходили в активные. Оказывается, для успешной инфекции достаточно только TL-района! И тогда клетки опухоли активируют «запасные» формы ауксинов самого растения, а это приводит к ризогенезу, т. е. к образованию многочисленных придаточных корней на месте опухоли. Итак, в результате переноса Т-ДНК из Ti-плазмиды в клетку растения-хозяина происходит неконтролируемое образование гормонов (ауксинов и цитокининов), что приводит к злокачественному росту клеток и дальнейшему синтезу азотсодержащих веществ — опинов. К месту опухоли притекает всё больше и больше аминокислот, но они постоянно «выводятся из оборота» растения, т. к. преобразуются в новые порции опинов, которые служат источником питания для соответствующего штамма агробактерий. «Избавиться» от чужеродной ДНК растительные клетки уже не могут. Рост клеток и синтез опинов продолжаются даже в том случае, когда агробактерии по каким-либо причинам погибли.
Получение генетически модифицированных растений при помощи агробактерий
Рис. 4. Репортёрный ген глюкуронидазы позволяет по синей цветной реакции определить, что растение генетически модифицировано (источник фотографии)
Оказывается, гены Vir-района переносят в клетку растений любые последовательности ДНК, которые заключены между двумя 25-нуклеотидными повторами. Гены из Т-района всё равно «не работают» в клетках агробактерий. Поэтому агробактерий можно «обмануть»: вместо «нормальных» генов включить в Т-ДНК те гены, которые нужны человеку. Тогда вся система инфекции сработает, но в растение попадут совсем другие гены! Тем не менее, при воплощении в жизнь такой, на первый взгляд, простой идеи возникли некоторые сложности. Главная из них — раз-меры Ti-плазмид, которые не позволяют выделять их из клеток агробактерий. Тогда учёные решили разделить Ti-плазмиду на две части: в одной оставить Vir-район, а в другой (теперь уже маленькой) — Т-район. Плазмиду с Vir-районом называют «помощником» (или хэлпером, от англ. help — помогать).Маленькую плазмиду с искусственным Т-районом можно выделять из клеток бактерий, «резать/клеить» при помощи специальных ферментов в пробирках, вставляя нужные гены в Т-район, а затем размножать в кишечных палочках (Escherichiacoli) и переносить в агробактерии. Чтобы ни одна из плазмид «не потерялась», каждую снабдили генами устойчивости к разным антибиотикам. Теперь, выращивая бактерии на среде с определённой комбинацией антибиотиков, можно отбирать клетки, в которые попала либо одна из плазмид, либо обе. Итак, задача практической работы с Ti-плазмидой решена. Но как понять, произошёл ли перенос ДНК из Т-района? Ведь теперь в клетки не попадают гены биосинтеза ауксинов и цитокининов, и опухоль образоваться не может. Кроме интересующего учёных гена (так называемого гена интереса) в Т-район обязательно вставляют ген устойчивости к какому-нибудь третьему антибиотику, который действует на растительные клетки. В среду кроме питательных веществ добавляют ауксин и цитокинин, а также антибиотики в новом сочетании: так, чтобы агробактерии и растительные клетки без встав-ленного Т-района погибли, а выжили бы генетически модифицированные клетки. Как вы помните, ауксин и цитокинин нужны для деления растительных клеток. В итоге должна вырасти каллусная масса из генетически модифицированных клеток. Получить из неё новые растения можно всё теми же методами биотехнологии (см. «Потенциал. Химия.Биология» №10 за 2011 год).На всех этапах работы хорошо бы посмотреть, в какие именно клетки попала искусственная Т-ДНК. Для этого в Т-район вводят ещё один ген — репортёрный. Основное требование к нему — продукт гена не должен встречаться в обычных растительных клетках и должен легко и быстро выявляться. В качестве репортёрных на сегодня чаще всего используют два гена: глюкуронидазы (из бактерий) и зелёного флуоресцирующего белка (из медузы). Глюкуронидаза даёт цветную реакцию с синтетическим веществом, при которой генетически модифицированные клетки окрашиваются в тёмно-синий цвет (рис. 4). Есть только один недостаток: клетки при таком окрашивании погибают. Зелёный флуоресцентный белок светится при освещении светом с определённой длиной волны, и клетки не погибают (рис. 5).
Рис. 5. Зелёный флуоресцентный белок в качестве репортёра позволяет наблюдать за живыми клетками в растениях (источник фото)
И лишь на последних этапах проверяют, работает ли ген интереса (как правило, приходится проводить многочисленные анализы на наличие определённых последовательностей ДНК, РНК и на сам белковый продукт гена интереса).
Таким образом, в любом генетически модифицированном растении кроме гена интереса есть «балласт» или «генетический мусор», представленный как минимум геном репортёром и геном устойчивости.
При помощи различных ухищрений с геном интереса можно получить растения, содержащие новый белковый продукт, которого раньше в клетках растений не было. Или, наоборот, можно «выключить» какой-нибудь собственный ген растения, «заставить» его работать в других органах и тканях и т.д. Это позволяет учёным детально исследовать работу генома растения. Но у генетически модифицированных растений есть и практическое применение.
Специалисты отдела защиты растений АПК «Витус» осуществляют энто-фитопатологическое обследование зелёных насаждений, разрабатывают индивидуальные планы мероприятий по защите растений, осуществляют комплексный уход за зелёными насаждениями.
Отдел защиты растений АПК «Витус» :
ltd_vitus@inbox.ru
8 916 650 69 98